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实验手册

TargetAmp 1-Round Aminoallyl-aRNA Amplification Kit采用改进的Eberwine 线性RNA扩增程序,可以从25ng的总细胞RNA中扩增出足量的多聚A RNA。这个试剂盒使用的是SuperScript Ⅲ 逆转录酶（用户自备）。6小时就可以完成RNA扩增反应。 

TargetAmp 1-Round RNA扩增反应的步骤：

1. cDNA第一条链的合成：

总RNA样品中具有多聚A序列的RNA被逆转录成cDNA的第一条链。合成的多聚T引物引发这个逆转录反应，同时在多聚T引物的5’端含有一个噬菌体T7RNA聚合酶启动子序列。SuperScriptⅢ 逆转录酶在一个较高的温度下催化CDNA第一条链的合成，升高的温度可以减少RNA的二级结构。

2. CDNA第二条链的合成：

在第一步中合成的cDNA：RNA杂交体中的RNA被RNase H水解成RNA片段。这些片段将作为合成cDNA第二条链的引物。合成的最终结果是产生双链cDNA，这个双链cDNA包括一个T7转录启动子，在体外转录反应过程中此启动子可以引导合成反义RNA（即aRNA）。合成的 cDNA可以直接用于体外转录反应，不需要纯化。

3. 体外转录合成Aminoallyl-aRNA：

利用上一步骤中合成的双链cDNA作为模板，可以在体外快速转录合成高产量的Aminoallyl-aRNA。在这个转录反应当中，传统的UTP被5-（3-Aminoallyl)-UTP（aminoallyl－UTP;AA-UTP）所代替。

4. aminoallyl-aRNA的纯化：

在步骤3中合成的aRNA利用离心柱色谱法进行纯化。

TargetAmp 1Round Aminoallyl－aRNA Amplification Kit 101的特点和优点: 

1)  将总RNA中含有多聚A序列的RNA片段扩增5000倍以上。

2)  可以从少至25ng的总RNA中扩增出高产量的aminoallyl-aRNA。

3)  采用改进的Eberwine 线性RNA扩增过程。

4)  非模板依赖性反应。

5)  高产量。

6)  一管中完成反应。

7)  在体外转录反应前不需要对cDNA模板进行纯化。

8)  费时少，完成扩增反应只需要6小时。

9)  使用方便：彩色标记试管以及柱形使用说明图表可以减少工量和差错。

TargetAmp 2-Round Aminoallyl-aRNA Amplification Kit 1.0采用改进的Eberwine 线性RNA扩增程序,可以从10pg的总细胞RNA中扩增出足量的多聚A RNA。这个试剂盒使用的是SuperScript Ⅲ 和SuperScript Ⅱ逆转录酶（用户自备）。

TargetAmp 2-Round RNA扩增反应的步骤:

1. 第一轮反应，cDNA第一条链的合成：总RNA样品中具有多聚A序列的RNA被逆转录成cDNA的第一条链。合成的多聚T引物引发这个逆转录反应，同时在多聚T引物的5’端含有一个噬菌体T7RNA聚合酶启动子序列。SuperScriptⅢ 逆转录酶在一个较高的温度下催化CDNA第一条链的合成，升高的温度可以减少RNA的二级结构。

2. 第一轮反应，cDNA第二条链的合成：在第一步中合成的cDNA：RNA杂交体中的RNA被RNase H水解成RNA片段。这些片段将作为合成cDNA第二条链的引物。合成的最终结果是产生双链cDNA，这个双链cDNA包括一个T7转录启动子，在体外转录反应过程中此启动子可以引导合成反义RNA（即aRNA）。合成的 cDNA可以直接用于体外转录反应，不需要纯化。

3. 第一轮反应，体外转录合成RNA：利用上一步骤中合成的双链cDNA作为模板，可以在体外快速转录合成高产量的aRNA。

4. 第一轮反应， aRNA的纯化：在步骤3中合成的aRNA利用离心柱色谱法进行纯化。

5. 第二轮反应，cDNA第一条链的合成：在第一轮中合成的RNA纯化后作为此步骤的模板被逆转录为cDNA的第一条链，催化此反应的酶是SuperScriptⅡ（用户自备）。 此反应的引物是具有随机序列的六对引物。

6. 第二轮反应，cDNA第二条链的合成：在上一步骤中合成的cDNA：RNA杂交体中的RNA被RNase H水解成RNA片段。含有T7启动子的寡聚T引物引发cDNA第二条链的合成，终产物是双链cDNA，这个双链cDNA包括一个T7转录启动子，在第二轮的体外转录反应过程中此启动子可以引导合成反义RNA（即aRNA）。

7. 第二轮反应，转录合成aminoallyl-aRNA：利用上一步骤中合成的双链cDNA作为模板，可以在体外快速转录合成高产量的Aminoallyl-aRNA。在这个转录反应当中，传统的UTP被5-（3-Aminoallyl)-UTP（aminoallyl－UTP;AA-UTP）所代替。

TargetAmp 2-Round Aminoallyl－aRNA Amplification Kit 1.0的特点和优点:

1. 将总RNA中含有多聚A序列的RNA片段扩增5000000倍以上。

2. 可以从少至10pg的总RNA中扩增出mg级的aminoallyl-aRNA。

3. 采用改进的Eberwine 线性RNA扩增过程。

4. 非模板依赖性反应。

5. 高产量。

6. 一管中完成反应。

7. 在体外转录反应前不需要对cDNA模板进行纯化。

8. 费时少，完成扩增反应只需要2天。

9. 使用方便：彩色标记试管以及柱形使用说明图表可以减少工量和差错。